DNA甲基化是一种重要的表观遗传学标记，在调控基因表达、细胞的分化与发育等过程中发挥着关键作用。随着年龄的增长，生物体内的DNA甲基化也会经历动态的变化，在哺乳动物中，已经证明了DNA甲基化与衰老相关(Zampieri et al., 2015, Niederhuth et al., 2016)。在禾本科植物中，毛竹与水稻不同需要几十年的时间才能从营养生长过渡到生殖生长，而在此过程中DNA甲基化的转变及其对开花的影响仍然未知。
除了DNA甲基化，环状RNA（circRNA）也参与了表观遗传调控过程(Wu et al., 2019)。环状RNA是通过反向剪接产生的长链共价、具有封闭结构的环形RNA。环状RNA可以抵抗核酸外切酶的降解，因此可以用作生物标志物(Vo et al., 2019)。已有报道显示，环状RNA在拟南芥、玉米、水稻和毛竹等植物中普遍存在。然而，DNA甲基化与环状RNA之间的联系尚未研究清楚。在动物中，环状RNA侧翼内含子中的反向互补序列调控其生成(Capel, 1998, Wilusz, 2015, Zhang et al., 2016)，但植物中环状RNA的生成并不依赖侧翼内含子的反向互补序列(Ye et al.,2015)，那么植物中的环状RNA是通过何种机制产生的，这一问题仍有待探索。2021年1月28日，福建农林大学林学中心顾连峰教授课题组与加州大学洛杉矶分校Steve Jacobsen院士合作在Plant Journal期刊在线发表了题为“Whole genome characterization of chronological age-associated changes in methylome and circular RNAs in moso bamboo (Phyllostachys edulis)from vegetative to floral growth” 的论文。
本研究采集了毛竹的三周实生苗叶片（TW）、一年实生苗叶片（OY）、开花前一年毛竹叶片（FLNY）、开花期毛竹叶片（FL）及花序组织（FP）样本，通过亚硫酸氢盐测序（BS-seq）、单分子Nanopore DNA测序、转录组测序（RNA-Seq）和小分子RNA测序等多组学关联方法揭示毛竹开花的表观遗传学调控。结果表明，随着年龄增长，CG和CHG甲基化比CHH更为稳定，转座子和注释基因中的CHH甲基化水平在营养生长到生殖生长过程中逐渐积累，这种CHH的变化是由24nt-siRNA和DRM2引起的，这为人们提供了一种可以检测毛竹叶片年龄的表观遗传学标记。
本文研究显示，当基因的表达水平逐渐增加时，转录起始位点和转录终止位点周围CG和CHG甲基化逐渐减少，而转录终止位点周围的CHH甲基化却逐渐增加。启动子中的CG/CHG甲基化与基因表达之间存在负相关，而CHH甲基化则与基因表达正相关。内含子区域的CG甲基化水平高于外显子区域，随着基因表达水平的增加，CG甲基化先升高后下降，而CHG和CHH甲基化在内含子或外显子区域呈现降低的趋势。通过对CG获得或丢失位点的差异甲基化区域基因做基因本体（GO）富集分析，发现与营养生长到生殖生长相变过程相关的GO明显富集。最后，与开花相关的基因在开花材料中呈现较高的表达，这可能与甲基化的调控有关。本研究提供了DNA甲基化随年龄变化的动态变化信息，为最终揭示DNA甲基化调控毛竹年龄和开花的机制提供了重要铺垫。
通过分析转录组数据，找到了不同年龄材料间差异选择性剪切事件，这些差异选择性剪切的GT和AG拼接位点附近呈现超高甲基化或超低甲基化状态。除了选择性剪切本文也分析了选择性多聚腺苷酸化和DNA甲基化之间的关系，发现与整体DNA甲基化谱相比，内含子区域包含poly(A)位点的基因具有更高的CG甲基化水平，但近端和远端poly(A)位点区域呈现相似的DNA甲基化水平。
最后，本研究利用高富集的环状RNA分离方法（RPAD）得到circRNA，用于下游文库构建和测序，结果显示circRNA两侧的内含子区域高度甲基化，并且侧翼内含子中富含24nt siRNA。通过分析发现，转座子的富集是侧翼内含子高度甲基化的原因，而LTR是其中最常见的转座子类型。为了验证转座子和环状RNA生物发生之间的关系，分别构建了2个来源于PH01000306G0430，包含TE（OE-2）和不含TE（OE-1）的环状RNA过表达载体。通过毛竹的原生质体转化实验，发现在TE存在下（OE-2），环状RNA的表达水平明显高于没有TE的情况，表明侧翼内含子中的TE可能会影响环状RNA的生成。 福建农林大学林学院的硕士生张泽宇、博士生王慧慧、王永生、席飞虎、王汇源和文中其他合作者完成了本文的工作。加州大学洛杉矶分校Steve Jacobsen院士和福建农林大学林学中心顾连峰教授和为本文通讯作者。本研究得到了国家重点研发计划“竹资源高效培育关键技术研究”项目(2018YFD060010101)的资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.15174
