近日，我院顾连峰教授课题组在《植物生物技术杂志》Plant Biotechnology Journal期刊发表了题为BaMV-Vectored Compact AsCas12f1-HKRA Enables Transgene-Free Genome Editing in Moso Bamboo (Phyllostachys edulis)(基于竹花叶病毒载体的紧凑型AsCas12f1-HKRA系统实现毛竹的非转基因编辑)的研究论文。该研究采用结构更紧凑、调控更协同的single transcript unit (STU)表达架构，对双启动子驱动的BaMV-gRNA-Cas9系统进行优化，通过比较多种微型Cas12蛋白的活性，在竹类植物中验证其编辑效能，探究适用于竹子的多功能基因编辑平台BaMV-CasSTU。

本研究首先基于STU策略，构建了靶向本氏烟草内源NbPDS基因的两种BaMV-Cas9STU系统。实验结果显示，BaMV-STU-Cas9与BaMV-STU-Cas9-tRNA系统均实现高效编辑，效率分别达58.9%与64.1%。进一步，将多种工程化Cas12蛋白变体（包括AsCas12f1HKRA/YHAM、nCas12j2、vCas12j2及enCas12j8）与优化后的gRNA整合，构建了一系列BaMV-Cas12STU系统。接种四周后，BaMV-STU-AsCas12f1HKRA-tRNA系统在植株中引起显著白化表型，并随时间扩展至茎与花萼。较原有系统提升3.4倍。 这些结果确认BaMV-STU-AsCas12f1HKRA-tRNA在多种Cas系统中性能最优。为验证其多重编辑能力，研究构建了双靶点与三靶点载体，同步靶向本氏烟草的PDS、PSY与RDR6基因。结果表明，系统可在多个位点同时实现有效编辑，双靶点载体中两基因平均编辑效率均超过53%，与单靶点效率相当；三靶点载体中三个基因也均获有效突变，证明该系统支持高效多重基因组编辑。

最后，在毛竹中对比了四种编辑系统靶向PheRDR6基因的效率。结果显示，三种STU优化系统（BaMV-STU-Cas9、BaMV-STU-Cas9-tRNA及BaMV-STU-AsCas12f1HKRA-tRNA）均显著提升编辑效率，达原有系统的2.3–2.7倍。进一步使用BaMV-STU-AsCas12f1HKRA-tRNA系统靶向毛竹PhePDS基因，在不同靶点均检测到编辑事件，编辑效率可达32.1%，并在新生组织与分蘖中均成功实现编辑。序列分析还发现，该系统能诱导长片段缺失。 综上所述，该研究成功优化了BaMV介导的CRISPR-Cas基因组编辑系统。BaMV-STU-AsCas12f1HKRA-tRNA系统在毛竹中展现出高效的AsCas12f1HKRA蛋白与gRNA递送能力，为竹类基因功能研究与遗传改良提供了候选工具。  

                                 图1.竹花叶病毒介导的单转录单元CRISPR-Cas系统在基因组编辑中的应用

福建农林大学林学院博士生吴林和海峡联合研究院顾煜莹和郭弘珏为论文共同第一作者，研究生张珺、杨珺、张孟颖等也参与了本项目, 海峡联合研究院顾连峰教授为论文通讯作者。该研究得到"十四五"国家重点研发项目、基金委面上项目和福建农林大学林学院高峰学科的支持。